Filho de um executivo da área de publicidade e de uma fotógrafa, Luke desenvolveu interesse pela dramaturgia ainda como estudante do Occidental College, onde se destacava como corredor. Ele e os irmãos, Owen e Andrew, seguiram a carreira cinematográfica. Luke estreou nas telas em 1993, dirigido pelo amigo Wes Anderson no filme "Pura Adrenalina" (1994), inicialmente um curta-metragem de apenas 13 minutos. Exibido no festival de cinema de Sundance, o curta chamou a atenção do diretor James L. Brooks, que ajudou a financiar o longa-metragem de mesmo nome, com uma versão estendida da história, em 1996. No filme, Luke e o irmão Owen interpretam dois ladrões.

Após o lançamento do filme, Wilson se mudou para Hollywood com os dois irmãos, onde atuou no filme "No Embalo da América" (1997). Em seguida, representou papéis de destaque em três comédias ‒ "Best Men" (1997), "Bongwater" (1997) e "Nosso Louco Amor" (1998), sendo os dois últimos coestrelados pela atriz Drew Barrymore, com quem Wilson namorou ‒ que lhe renderam convites para papéis semelhantes nos anos seguintes. Ainda em 1998, atuou em "Romance no Parque"; em 1999, coestrelou com Martin Lawrence a comédia "Um Tira Muito Suspeito", seguido de "O Rei das Cópias" (1999). Seus dois filmes seguintes ‒ "As Panteras" (2000) e "Legalmente Loira" (2001) ‒ foram grandes sucessos de público, tornando-o ainda mais conhecido.

Afastando-se da comédia, o ator estrelou os thrillers "Preston Tylk" (2000) e "Alucinação" (2001), mas voltou ao gênero em 2001, ao retomar a parceria com o irmão Owen Wilson e o amigo Wes Anderson para filmar "Os Excêntricos Tenenbaums". Em 2003, repetiu o papel de namorado de Cameron Diaz na sequência "As Panteras ‒ Detonando" e o de namorado de Reese Whiterspoon em "Legalmente Loira 2". No mesmo ano, estrelou "Dias Incríveis" (2003) e, em 2005, interpretou o papel principal em "Ladrão Que Engana Ladrão", filme que dirigiu junto com o irmão Andrew Wilson.