Nascido em Washington, mas criado na Carolina do Sul, é o mais novo de onze irmãos de uma família de origem católica irlandesa. Colbert trabalha na rede de televisão Comedy Central desde 1997, atuando inicialmente como "correspondente" do jornal humorístico The Daily Show - como os outros supostos correspondentes do programa, ele gravava suas inserções em estúdio. Colbert era conhecido pelo estilo irônico, utilizando-se de aparentes falácias para ilustrar uma mensagem de forma enviesada.
O sucesso alcançado no Daily Show levou à saída, em 2005, para apresentar seu próprio programa jornalístico na emissora: o Colbert Report, onde satiriza o pensamento conservador dos Estados Unidos; sua crítica é dirigida, em especial, ao Partido Republicano e à emissora Fox News. Protagonista do Colbert Report, Stephen Colbert representa uma personagem, de mesmo nome, que se caracteriza pela ingenuidade e ignorância, fé na corrente política do então governo Bush e idolatria ao jornalista conservador Bill O'Reilly, cujo show The O'Reilly Factor serviu de inspiração para o The Colbert Report.
Em 2007, Colbert publicou o livro I Am America (And So Can You), que encabeçou a lista dos mais vendidos do jornal The New York Times, além de participar anteriormente do best-seller America (The Book). Ele já esteve presente na lista das 100 pessoas mais influentes do mundo, editada pela revista Time; recebeu três prêmios Emmy e dois Peabody. Em outubro de 2007, Stephen Colbert anunciou em seu show a sua candidatura à presidência dos EUA, pelo Partido Democrata. Inicialmente, sua intenção era de se candidatar por ambos partidos republicano e democrata, mas desistiu da ideia, já que precisava de US$ 35.000 para se candidatar pelo Partido Republicano, contra apenas US$ 2.500 do partido Democrata. Em 2006, Stephen Colbert recebeu grande atenção da mídia ao ser convidado especial do jantar anual da associação dos correspondentes da Casa Branca. Durante sua performance, ele fez diversas críticas ao governo Bush e à mídia através de piadas satíricas.