A série tem como inspiração o trabalho da Cyber Psicóloga irlandesa Mary Aiken, especialista em problemas gerados pela internet. A série terá como foco crimes que acontecem ou aconteceram na internet, e acompanhará Avery Ryan, uma Agente Especial do FBI, responsável pela Divisão de Crimes Cibernéticos em Quantico, Vírginia. Ela é a encarregada de investigar os crimes que tiveram início na mente, tomaram vida no mundo virtual e afetaram o mundo real. Ela também sabe em primeira mão como a tecnologia de hoje permite que as pessoas se escondam nas sombras da Internet e cometam crimes graves de proporção global. Enquanto outros agentes procuram criminosos em casas escuras e em becos, Ryan procura a "Deep web", um lugar nas ''entranhas'' da internet onde os criminosos são anônimos, o dinheiro é indetectável e onde tudo está à venda, com apenas um toque na tecla.

Fazendo alterações já previstas para a segunda temporada, os produtores decidiram retirar o personagem de Peter MacNicol, Simon Sifter, da série, trazendo então D.B. Russell, interpretado por Ted Danson (da série original CSI), para CSI: Cyber, mas não para ocupar o lugar que Simon tinha no FBI, e sim para supervisionar a recém criada Divisão de Criminalística Cibernética.